大肠杆菌“偷师学艺”后，都会染牛仔裤了|微生物“智”造
蓝色牛仔裤，起初是作为淘金矿工的工装裤存在的，而在今天的生活中，蓝色牛仔裤已经成为时尚界的宠儿，基本已经是我们人手一件的时尚单品。牛仔裤的经久不衰，其背后离不开一种古老的染料——靛蓝，或明亮或深沉的蓝色，赋予了牛仔裤时尚感的灵魂。
包含牛仔裤在内，全世界每年需要使用5-6万吨靛蓝染料对超过40亿条织物染色。但鲜为人知的是，当前靛蓝的制造和使用过程存在着诸多对环境不友好的因素，如有毒化学品的使用等，会对环境造成较大的污染。
靛蓝染色技术，在我国春秋战国时期就已经被应用，时至今日，靛蓝的生产和利用都有哪些方式？如何避免大规模生产和利用导致的环境污染呢？
（图片来源：veer图库）
靛蓝来自何处？
靛蓝是一种微溶于水的非偶氮类着色剂（编者注：有机合成色素从结构上分为偶氮色素类——苋菜红、胭脂红、日落黄、柠檬黄等，和非偶氮色素类——靛蓝、赤藓红、亮蓝等）。它的使用历史超过6000年，古埃及木乃伊穿着的一些服装和我国马王堆出土的蓝色麻织物等都是由靛蓝所染成的。
靛蓝可能的获取途径主要有三类：
1.植物制备法
第一类是从植物中获取，能用来制备靛蓝的植物包含菘蓝（Isatis indigotica Fortune）、蓼蓝(Polygonum tinctorium Ait)和马蓝（Strobilanthes cusia(Nees) Kuntze）等，靛蓝往往以靛苷的形式存在于这些植物内部。
靛蓝及蓼蓝（图片来源：维基百科）
靛蓝是人类所知最古老的色素之一，而植物是最初人类寻找靛蓝的来源，从植物中制备靛蓝有着非常悠久的历史，古代很多著名的科学典籍比如为《齐民要术》、《天工开物》和《本草纲目》等都有记载其制备方式。
《本草纲目》中讲得很清楚，“南人掘地做坑，以蓝浸水一宿，入石灰搅至千下，澄去水，则青黑色。亦可干收，用染青碧。” 现在用科学所赋予我们的“上帝视角”去看这个朴素的方法，它可以被理解成“挖一大坑作为反应容器，将蓝草与水混合发酵一晚，给微生物发挥的空间，用微生物产的糖苷酶将靛苷中的糖基去掉释放出吲哚酚，加入石灰水创造出一个便于形成靛蓝的碱性环境，吲哚酚会被空气中的氧气氧化，最终反应生成靛蓝。”
尽管从历史时间轴上来看，这种生产方式曾占据非常重要的位置，但是天然靛蓝制造方式有着产量有限、染色牢度低、染色的重现性较差等缺点，而且菘蓝、蓼蓝等植物的种植和采集都受到地域和时间的限制。因此在当今社会，这种方式并不适合用于大规模生产靛蓝，而是作为传统文化遗产的一部分，在中国的部分地区被沿用，我国瑶族中的一支因其生产和使用靛蓝染布的技术独特而得名“蓝靛瑶”。
2.化学合成法
获取靛蓝的第二种途径是化学合成，它是当前获取靛蓝的主要方式。靛蓝化学合成的历史始于一个童年时期就开始对靛蓝产生兴趣的化学家阿道夫·冯·拜尔（Adolf Von Baeyer）。拜尔自1865年开始研究靛蓝的化学合成，最终在1880年左右提出第一个靛蓝的化学合成路线，并且申请了第一个合成靛蓝的专利，随后相关专利被德国一家公司购买，经过了17年的技术开发，最终于1897年实现了合成靛蓝的工业化生产。
1905年，拜尔因其在有机染料和芳香族化合物的研究而被授予诺贝尔化学奖。
拜尔（图片来源：诺贝尔基金会）
截止目前，被提出的靛蓝合成路线已多达30多条，其中部分走入到了商业化阶段，合成路线的前体如下图所示。
一种代表性的靛蓝合成路线及部分其它路线所使用的前体
（从左往右分别为苯乙酸、甲苯、β-苯胺、邻氨基苯甲酸）（图片来源：参考文献[3]）
相比植物靛蓝，合成靛蓝在经济和性能上的优越性无需赘言，其影响力能延续100多年就是最好的例证。但是前体有毒、合成过程中涉及有毒化学品、需要使用强酸或强碱、反应温度较高是这些合成路线中对环境不友好的因素，这也激励着科学家不断寻找新的靛蓝生产方式。
3.微生物制备法
获取靛蓝的第三个可能的途径是微生物，但是这个方向的研究相对较为滞后。从1927年开始，科学家陆续发现一些能合成靛蓝的微生物，而50多年后的1983年，科学家才在大肠杆菌中重现出其它微生物合成靛蓝的能力，通过“建物致知”的策略对微生物合成靛蓝的途径有了一些头绪（编者注：建物致知，即通过构造人工生物系统来研究生命科学中的基本问题）。
又经过了将近40年的时间，今天的生物工程师们可以利用明星微生物大肠杆菌生产靛蓝，滴度可以达到1g/L左右。尽管这个生产过程比较环保，反应条件也足够温和，但是考虑到产率低、纯度低以及底物昂贵所导致的成本问题，这种途径现阶段还没有产业化的可能性。
微生物所具备的由吲哚向靛蓝的合成途径（图片来源：参考文献[4]）
揭开衣物变蓝的秘密
了解完靛蓝的来源，还得了解靛蓝是怎样被使用的。靛蓝微溶于水，利用它染色前，首先需要将其转化成能溶于水的形式。
溶解性判定表（图片来源：自制）
靛蓝染色的过程其实很简单，我们可以简单理解为靛蓝先被还原为溶解性较好的靛白——靛白吸附至织物中的纤维表面——织物中的靛白氧化重新成为靛蓝，织物成为蓝色的过程。
我们传承了千年的传统工艺是将靛蓝、酒糟、草木灰等混合，草木灰为混合后的液体创造出碱性的条件，在这种条件下微生物发酵产生的氢气能够还原靛蓝，将其转化成可溶于水的隐色体靛白。织物和靛白溶液混合后，靛白可以很好的与织物中的纤维结合，再将浸染的织物置于空气中，空气中的氧气又会将靛白再重新氧化回靛蓝，如此反复几次，染色过程基本就完成了，通常整个过程会需要7-10天。
现代染色过程中占据主导位置的方式是保险粉还原法，保险粉的学名是连二亚硫酸钠，是一种还原剂。在氢氧化钠提供的碱性条件下，保险粉可以快速将靛蓝还原成靛白，后续的过程同样是经过氧气的氧化最终再将靛白重新转化成靛蓝。
这个方法基本是目前染色效果最好的策略，但是保险粉本身性质活跃，易吸湿结块而分解消失，有刺激性气味，遇明火或高温还容易发生爆炸，另外染色废水的pH值也较高，含大量亚硫酸盐。这样的缺点使得它需要被替代的必要性很高。
大自然启示下的新策略
大自然包罗万象，我们人类苦思不得其解的问题，她往往早已给出了答案，但大自然最真实最奇妙的一面只为那些愿意在她身上花足够心思的人而绽放。
关于如何在高效合成并利用靛蓝染色的同时还不造成对环境的危害这个问题，一些植物学家和生物工程师在2018年才读懂了大自然早已给出的暗示，并且成功地进行了模仿。
这个暗示起源于一个现象，即在能用来制备靛蓝的植物蓼蓝中，正常的叶片展示出的颜色是普通的绿色，但是当叶片被破坏后，破损的地方会变成蓝色。
蓼蓝叶片中靛蓝的合成途径（Tammy M Hsu et al., 2018）（chloroplast：叶绿体；vacuole:液泡；BGL：β-葡糖苷酶）
植物学家最先注意到了这个现象，并开始不断求索，帮助我们看到了这个现象背后的本质。蓼蓝叶片在正常情况下不显蓝色是因为叶片中不存在现成的靛蓝，而是存在由靛蓝的前体吲哚酚和一个葡萄糖结合而成的靛苷。
靛苷存在于细胞的液泡之中，相较于靛蓝水溶性好，没有颜色。叶片受损时会变蓝，主要是由于叶绿体中的β-葡糖苷酶（BGL），它能够水解靛苷中的葡萄糖基团，释放出吲哚酚，而吲哚酚在氧气的氧化之下又能逐步变成靛蓝。
葡糖苷酶和靛苷正常情况下位于不同细胞器内，老死不相往来，但是破损时两个细胞器的膜均被破坏，葡糖苷酶和靛苷能够得以混合，给靛蓝的最终形成创造了条件，也就形成了和正常叶片颜色不同的表型。
仿生的要义在于取其精髓，这个现象的阐明为想要改变靛蓝生产使用方法的生物工程师提供了启发，对这个现象进行一通分析之后，他们发现，有两个酶在靛蓝生产中发挥着重要的作用，一个负责将比较活跃的吲哚酚转化成稳定的靛苷，即糖基转移酶；一个负责水解靛苷中的糖基，即葡糖苷酶（它是蓼蓝叶片破损后变蓝的关键）。想要模仿植物的这个过程，化用这两个酶的功能是最必要的操作。
经过一番研究后，大肠杆菌成为生物工程师们模仿植物生产利用靛蓝策略的对象。2018年，他们提出并实现了一种全新的、可持续性的靛蓝染色策略，如下图所示。
葡糖糖基保护基团促使的靛蓝染色时间和空间控制（Tammy M Hsu et al., 2018）
新的策略先是将吲哚酚的合成途径引入到了大肠杆菌中，完成此次精准模仿的生物工程师的创见在于，他们找到了植物中的糖基转移酶，并且将其表达到了大肠杆菌中，这样大肠杆菌就直接产生了稳定的靛苷，包含靛苷的溶液可以直接被当作染液去浸染织物。
之后再将一个来源于环形芽孢杆菌的葡糖苷酶在另一个大肠杆菌中表达，这个大肠杆菌可以将葡糖苷酶分泌到细胞外的培养基中，最后利用包含葡糖苷酶的培养基再去洗与靛苷混合过的织物，将织物上存留的靛苷转化成吲哚酚。吲哚酚经氧气的氧化变成靛白，最后再转化成靛蓝，这样就完成了一轮染色。
这样一来，新的策略中靛苷可以被视作一种染料分子，它的生成过程完全来源于微生物——大肠杆菌，基本避免了有毒化学品的使用以及苛刻的反应条件。由靛苷到靛蓝的利用过程靠的也是来源于微生物的功能和自然过程，规避掉了传统化学染色过程中连二亚硫酸钠的大量使用。从过程的环保和可持续性上完胜化学生产策略。
过程更环保了，那染色的效果及成本与传统化学方法相比究竟怎么样呢？我们可以通过一些图片和数字来略窥一二。
首先他们选择了了靛苷和靛蓝作为染料，接着分别用新策略和化学还原法进行染色，结果发现两种策略都能将试验所用的布料染成蓝色，尽管新策略的效果与化学还原法相比稍逊色一些。
从两种染色策略需要的染料滴度或者说浓度来比的话，通常的保险粉还原法染色时靛白的浓度大概是4g/L左右，要达到同等浓度，大肠杆菌产靛苷的滴度需要达到9g/L，但现在实际上的滴度只能达到2.9g/L，所幸靛苷比较稳定，浓度可以通过浓缩发酵液得到提升。
生物靛苷可以被用作一种有效的，不使用还原剂的棉纺织物染料（Tammy M Hsu et al., 2018）
注：图a中的3号和5号布片分别用生物靛苷和还原性靛蓝所染，b图为单独使用新策略进行染色后的围巾
两种染色策略有很大的区别，尽管新策略在经济性上还不能与化学合成靛蓝及染色相媲美，但考虑到靛蓝从第一次化学合成到最终的产业化也经历了将近20年，这个生物学家提出来的新的染色策略未来究竟能在这个行业扮演什么样的角色，我们还应该给生物工程师一些时间去跨越理想和现实的差距。（关于生物工程师的角色，你还可以了解更多）
这次仿生的故事还有后续，为这项工作做出主要贡献的作者在博士毕业后，凭借该项工作作为共同创始人和首席科学官创建了初创公司，旨在推动新型靛蓝染料的商业化应用，而她的导师则是该公司的学术顾问。这其实代表着一种非常好的科研模式：学生时代搞科研，针对现存的问题去提“从0到1”的解决方案，毕业后以学生阶段取得的科研成果为主做企业，去做“从1到99”的技术优化和提升。最终弥补理想和现实的差距，让实验室的科研成果能够真正的造福社会，这种科研范式非常值得有志于做产业化研究的初级研究人员所借鉴。
复盘这个精准模仿植物制造并利用靛蓝的过程，还能给我们带来一个启示，给未来复制类似的仿生操作提供参考：
首先作为一个优秀的研究人员，必须得关注或者去寻找重要的科学或工程问题。其次，必须得对与所关注问题相关的自然现象有足够的关注和了解，无论是直接的了解还是间接的了解，对自然现象了解的越透彻才有可能利用她的智慧。
参考文献：
[1] Hsu T M , Welner D H , Russ Z N , et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy[J]. Nature Chemical Biology, 2018.
[2]杨璧玲. 植物靛蓝染色传统工艺原理及应用现状[J]. 染整技术, 2008, 30(003):13-15.
[3]姚继明, 吴远明. 靛蓝染料的生产及应用技术进展[J]. 精细与专用化学品, 2013(04):13-18.
[4]马桥, 曲媛媛, 张旭旺,等. 靛蓝的微生物合成研究新进展[J]. 应用与环境生物学报, 2012, 18(002):344-350.
策划：李辉 吕雪峰
作者单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
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